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Zelllinienentwicklung

Die Revolution in der Einzelzellklonierung für die pharmazeutische Zelllinienentwicklung

Haben Sie es satt, tausende Zellen in riesigen Stapeln an Zellkulturplatten auszusäen nur um später herauszufinden, dass Sie weder Einzelzellen hatten, noch dass die Zellen überlebt haben oder produktiv sind? Haben Sie genug davon, hunderte Platten begutachten zu müssen, nur um den einen Klon zu finden, der alle Anforderungen erfüllt und zu dem gewünschten Titer führen wird?
Warum überlassen Sie ihre pharmazeutische Zelllinienentwicklung dem Zufall?
Mit dem CellCelector™, einer Plattform zur automatischen Isolierung von Einzelzellen und Zellkolonien, können Sie Ihre Klone nun effektiv beurteilen und verifizieren, bevor Sie sich entscheiden müssen, welche Sie auswählen.
Innerhalb einer einzigen Woche gelangen Sie von einem Pool an Einzelzellen zu vollen Platten mit Klonen, die gezeigt haben, dass sie monoklonal, lebensfähig und produktiv sind. Anstelle auf große Mengen an Platten zu setzen, um den einen erfolgreichen Klon zu finden, können Sie nun auf tatsächliche Daten vertrauen, die die Zukunft ihrer Klone prognostizieren. Das spart Ihnen eine Menge Material, Medium, Platz und vor allem Zeit, da Sie ihre Projektziele deutlich schneller erreichen können, ohne zeitraubende Fehltritte, einer zweiten Klonierungsrunde oder unnötigen Abläufen.

Einzelzellklonierung in nur einer Runde mit integriertem Monoklonalitätsnachweis und Viabilitätsassay

Der CellCelector kann nun auch für Hochdurchsatz Einzelzellklonierungen genutzt werden, um eine schnelle Generierung von klonalen pharmazeutischen Zelllinien zu ermöglichen. Die Klone werden in nur einer einzelnen Klonierungsrunde erzeugt, während ein im Prozess integrierter bild-basierter Monoklonalitätsnachweis durchgeführt wird (HT-NIC Methode: High Throughput Nanowell based Image verified Cloning).

Mit ihrem integrierten Monoklonalitäts- und Viabilitätsnachweis, wie auch mit branchenführenden Auswuchsraten nach dem Klontransfer in 96 oder 384-Well Platten, repräsentiert die CellCelector Einzelzellklonierungstechnologie die nächste Generation von Einzelzellklonierungsanwendungen.

Als solche geht sie wesentlich weiter als traditionelle Methoden und stellt eine überlegene Alternative zum Limiting Dilution Verfahren, FACS Sortierung oder Single Cell Printing Technologien dar. Diese patent-geschützte Methode wurde in Zusammenarbeit mit der ProBioGen AG und anderen CellCelector Kunden entwickelt und validiert.
Nanowell mit einer Einzelzelle

CellCelector™ Nanowellplatten

Nanowellplatte mit quadratischen Nanowells
Die HT-NIC Methode basiert auf den CellCelector™ Nanowell plates (verfügbar bei ALS). Diese Platten sind im 24-Well und 6-Well Format verfügbar und besitzen tausende kleine Nanowells am Boden jedes Wells. Abhängig vom Plattentyp ergibt das bis zu 4.300 bis 22.000 Nanowells pro Well oder zwischen 100.000 und 130.000 Nanowells pro Platte. Wenn sich einzelne Zellen in den Nanowells befinden, sind sie zwar räumlich voneinander getrennt. Jedoch sind alle Nanowells von demselben Medium überschichtet, wodurch die Zellen nicht komplett voneinander isoliert sind, sondern es zu einer effektiven Co-Kultivierung der Zellen kommt. Alle in einem Well ausgesäten Zellen unterstützen den Auswuchs der Zelllinie, während die Monoklonalität der Zellen bewahrt wird. Das führt zu branchenführenden Auswuchsraten von Einzelzellen, sogar für Zelllinien, die eher beschwerlich anwachsen und schwierig zu handhaben sind.

Der Arbeitsablauf der CellCelector™ nanowell-basierten Einzelzellklonierungsmethode

Das Aussäen der Zellen erfolgt in derselben Art und Weise wie in konventionellen Zellkulturplatten. Nach dem Aussäen werden die Zellen gemäß der Poisson-Verteilung zufällig auf die Nanowells verteilt. Das anschließende automatisierte Screening der ausgesäten Zellen in den Nanowells und die darauf folgende automatisierte Analyse führt zur Identifikation aller Nanowells mit exakt einer Zelle und bieten einen robusten und dokumentierten bildbasierten Monoklonalitätsnachweis. Auf diese Weise können in Abhängigkeit von der Zelldichte 400 bis 600 Einzelzellen pro Well analysiert werden. Durch die Nutzung mehrerer Wells kann so leicht mit bis zu 14.000 in Nanowells gefangenen Einzelzellen gestartet werden – alle in gerade einmal einer Nanowellplatte.
Pipettieren der Probe in die Nanowellplatte
Nachdem die Monoklonalität dokumentiert worden ist, können die Zellen für 3 bis 6 Tage im Inkubator auf bis zu 20 bis 75 Zellen pro Klon anwachsen. Im Gegensatz zur traditionellen methylzellulose-basierten Anwendung ermöglicht die CellCelector™ nanowell-basierte Methode das Wachstum in Flüssigmedium. Die Klone teilen sich dabei dasselbe Medium, bleiben durch die Nanowellwände aber räumlich voneinander getrennt. Nachdem die Einzelzellen zu Zellklonen herangewachsen sind, wird die Nanowellplatte erneut gescannt und alle monoklonalen, vitalen Klone werden automatisch selektiert und in 96-Well oder 384-Well Platten für weitere Analysen und das Upscaling überführt.
Zellwachstum im Nanowell

Der automatisierte Monoklonalitätsnachweis: Eine robuste Einzelzellerkennung in Nanowells

In konventionellen Einzelzellklonierungsabläufen werden Einzelzellen in 96-Well Platten ausgesät, wodurch eine zuverlässige automatisierte Einzelzelldetektion im Durchlicht schwierig durchzuführen ist, da die Zellen häufig genau am Rand des Wells liegen. Deswegen wird der Monoklonalitätsstatus der Klone am Tag 0 entweder manuell am Tag der Aussaat überprüft oder rückschauend, nachdem bereits kleine Klone herangewachsen sind. Aber warum sollte man eine einzelne Zelle in einer Fläche suchen, die weit über 100-mal so groß ist wie die Fläche, die durch die Zelle bedeckt wird?
Bei der CellCelector HT-NIC Methode werden die Zellen innerhalb der 200 µm großen Nanowells separiert, sind dabei deutlich erkennbar und können deshalb zuverlässig und automatisiert durch die Software detektiert werden, selbst direkt nach dem Aussäen oder wenn die Zellen die Nanowellwände berühren.
Bewertung der Monoklonalität: Nachweis von Einzelzellen in Nanowellen

Vergessen Sie die Limiting Dilution Methode, der CellCelector™ ermöglicht 100% Monoklonalität

Bei der Limiting Dilution Methode, einer weit verbreiteten traditionellen Methode für die Einzelzellklonierung, basiert die Monoklonalität einzig auf statistische Wahrscheinlichkeiten abhängig von der Zelldichte. Um die Anzahl der Wells mit mehr als einer Zelle einzuschränken, werden für gewöhnlich geringe Zelldichten mit nicht mehr als 0,2 Zellen pro Well ausgesät. Leider führt dies zu gerade einmal 16% an Wells mit nur einer Zelle, während der Großteil der Platte leer bleibt.  Um statistisch 400 Einzelzellwells zu erhalten, müssen so mindestens 25 96-Well Platten ausgesät und gescreent werden. Es ist möglich, die Anzahl an Einzelzellen zu erhöhen, indem man 0,5 Zellen pro Wells aussät, was jedoch gleichzeitig zu einer höheren Anzahl an nicht-monoklonalen Wells führt.

Durch die automatisierte Identifikation der Nanowells, die Einzelzellen enthalten, das Nachverfolgen des Wachstums zu Klonen und die kreuzkontaminationsfreie Überführung der herangewachsenen Klone in 96-Well Platten bietet die CellCelector HT-NIC Methode 100% monoklonale Wells unabhängig von der Probenvorbereitung, dem Zelltyp oder der ausgesäten Zelldichte.
Darstellung der Effizienz in der Gewinnung von monoklonalen Wells durch die CellCelector™ nanowell-basierte Klonierung im Vergleich zur Limiting Dilution Klonierung mit zwei verschiedenen Zelldichten.
Um 400 monoklonale Wells zu erhalten, müssen bei der Limiting Dilution Methode 26 (bei einer Zelldichte von 0,2 cells/well) bzw. 13 (bei einer Zelldichte von 0,5 Zellen pro Well) 96-Well Platten ausgesät werden. Für die gleiche Anzahl an monoklonalen Wells reicht lediglich ein Well einer CellCelector™ Nanowellplatte.

Erreichen Sie den höchstmöglichen Anteil an lebensfähigen Einzelzellklonen

Verglichen mit der Limiting Dilution Methode, durch die gerade einmal 10% bis 20% lebensfähige Einzelzellklone gewonnen werden können, erhält man mit anderen traditionellen Methoden, wie FACS Einzelzellsortierung oder Einzelzell-Printing eine höhere Anzahl an Wells mit Einzelzellen. Jedoch führen der hohe Scherstress bei der FACS Sortierung sowie die Tatsache, dass sich eine einzelne Zelle allein in einem großen Volumen an Medium befindet, zu unsicheren Auswuchsraten, die in einem Bereich zwischen 30% und 64% liegen. Desweiteren werden große Mengen an teurem Spezialmedium benötigt und sind diese Methoden ungeeignet für schwierig zu züchtende Zelllinien, die nicht aus einzelnen Zellen wachsen wollen.

Bei der CellCelector HT-NIC Methode teilen alle ausgesäten Zellen dasselbe Medium, wodurch eine Zell-Zell-Kommunikation stattfinden kann, ohne dass die Monoklonalität aufgegeben werden muss. Dies führt letztlich zu besseren Auswuchsraten. Erst wenn sich ein Klon als monoklonal und lebensfähig erwiesen hat, wird er selektiert und in 96-Well Platten überführt. Da es sich jetzt um einen lebensfähigen und monoklonalen kleinen Klon statt einer einzigen Zelle handelt, die übertragen wird, wird er auch in einem größeren Well weiterwachsen.

Einwegmaterialien verhindern die Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Proben

ALS bietet günstige austauschbare CellCelector™ Glaskapillaren und Nanowellplatten an, wodurch jegliche Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Proben verhindert werden kann. Eine Glaskapillare und eine Nanowellplatte  (oder nur einige Wells der letzteren) reichen aus, um ein Einzelzellklonierungsexperiment durchzuführen. Dabei gibt es keine Einschränkungen in der Anzahl der Zielplatten, in die die Klone transferiert werden sollen.

Im Falle von Budgetbeschränkungen können benutzte Glaskapillaren auch automatisch vom System gespült und desinfiziert werden.
Nanowellplatte - Fluoreszenz

Zuverlässige Einzelzellkloning in einer kontrollierten sterilen Umgebung

Incubator FlowBox (ohne Unterschrank) mit ALS CellCelector
Um eine sterile Umgebung für die Einzelzellklonierung zu gewährleisten, muss der CellCelectorin einer Sterilbank platziert werden. Bei dieser kann es sich entweder um eine standardmäßige Sterilbank handeln oder aber um die individuell angepasste Sterilbank, die zusammen mit dem System von ALS angeboten wird. Für weitere Verbesserungen des Zellüberlebens und der Assaystabilität kann der CellCelector auch in der ALS Incubator FlowBox installiert werden, welche nicht nur eine sterile Umgebung bietet, sondern auch eine regulierte Temperatur, Luftfeuchte und CO2, sowie UV Lampen für Sterilisationszwecke.
Bedienpult der Incubator FlowBox

Vorteile der CellCelector™ Einzelzellklonierung für die Zelllinienentwicklung

Einfache Nutzung


  • Einfache Probenvorbereitung

  • Benutzer-freundliche Software mit Funktionen, die speziell für die Zelllinienentwicklung entwickelt wurden

  • Keine routinemäßige Wartung notwendig

Leistung


  • 100 % Einzelzellklone

  • Einzelzellklonierung in einer Runde mit integriertem bildbasiertem Monoklonalitätsnachweis und Viabilitätsbeurteilung

  • Bis zu 95 % Überlebensrate der Klone nach dem Transfer in 96-Well Platten

Zuverlässigkeit


  • Bilder von hoher Qualität für eine robuste automatisierte und labelfreie Einzelzelldetektion und Monoklonalitätsnachweis für die FDA

  • 100 % selektive Klongewinnung ohne Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Klonen

  • Austauschbare Einweg-Glaskapillaren und Nanowellplatten verhindern eine Kreuzkontamination zwischen verschiedenen Projekten

  • Integrierte Verfolgbarkeit aller Klone von der Einzelzelle bis zum Klontransfer

  • Automatisierte Qualitätskontrolle des Klontransfer (Gepickt/ Fehlgeschlagen)

Zeit-, Material- und Platzeinsparungen


  • Nachweislich lebensfähige, monoklonale Klone in weniger als 6 Tagen

  • Signifikante Einsparungen der Kosten für Einwegartikel und Medium sowie Inkubatorplatz

  • Ein Well einer 24-Well Nanowellplatte resultiert in 200 bis 500 Zielklonen

  • Keine Notwendigkeit für zusätzliche bildgebende Systeme für den Monoklonalitätsnachweis

Flexibilität


  • Kompatibilität mit verschiedensten Zelllinien (CHO, HEK293; NS0, PER.C6 etc.)

  • Keine Einschränkung in der Zellgröße

  • Einfache Optimierung der Zelldichte oder des Mediums, da bis zu 24 Proben innerhalb einer Platte durchgeführt werden können

  • Kompatibel mit vielen anderen Arbeitsabläufen (Einzelzell B-Zell Screening, Hybridoma Screening, Gene Editing, Isolation seltener Zellen etc.)

  • Kompatibel mit einer großen Anzahl an standardmäßigen, sowie kundenspezifischen Ausgangs- und Zielformaten (Mikrotiterplatten, Petrischalen, Objektträger, PCR-Platten/ Reagenzgefäße etc.)
Möchten Sie mehr erfahren?
ZUGEHÖRIGE PRODUKTE
CellCelector für Einzelzellklonierung
CellCelector
Incubator FlowBox für Einzelzellklonierung
Incubator FlowBox
Nanowellplatte für Einzelzellklonierung
Nanowellplatten
Glaskapillaren für Einzelzellklonierung
CellCelector™ Glaskapillaren
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