Fetale Zellen (zellbasierte NIPD)
Isolierung einzelner fetaler Zellen aus mütterlichem Blut für die zellbasierte NIPD
In der pränatalen Versorgung kann es notwendig sein, Zugang zu fetaler DNA zu erhalten, um den sich entwickelnden Fötus auf genetische Krankheiten zu testen. Konventionelle pränatale Diagnosemethoden wie Chorionzottenbiopsie (CVS) oder Amniozentese sind belastend und invasiv und bergen ein Risiko für Spontanabbrüche. Gleichzeitig können im ersten Trimester der Schwangerschaft einige vom Fötus stammende Zellen im mütterlichen Blutkreislauf gefunden werden. Die Isolierung dieser fetalen Zellen aus einer mütterlichen Blutprobe ist eine attraktive Alternative zu herkömmlichen invasiven Verfahren, da sie eine risikoarme, nicht invasive pränatale Untersuchung (NIPD) und gleichzeitig die Isolierung des reinen und intakten fetalen Genoms ermöglicht (Abb.1).
Abb. 1. Schematische Darstellung (Singh et al.) der zellbasierten NIPD (cbNIPT) im Vergleich zur konventionellen Pränataldiagnostik (CVS) und zellfreier NIPD (cfNIPT). Basierend auf reinen fetalen Zellen, die nicht mit mütterlichem Genom verunreinigt sind, zeigt die zellbasierte NIPD eine vergleichbare Analysestärke wie konventionelle Methoden. Gleichzeitig ist die Methode ein auf Blutabnahme basierender Test, bei dem das Risiko und der Stress für die schwangeren Frauen wie im Fall des cfNIPT gering ist.
Fetaler zellbasierter vs. zellfreier DNA-Test
Nicht invasive Pränataldiagnostik, die auf der Analyse zirkulierender zellfreier fetaler DNA basiert (cfNIPD), wird derzeit in vielen Ländern eingeführt. Ihr Hauptproblem ist jedoch zum einen die geringe Reinheit des fetalen Genoms aufgrund eines Überschusses an mütterlicher DNA im Plasma sowie die Fragmentierung der DNA. Dies führt zu Schwierigkeiten beim zuverlässigen Nachweis atypischer Chromosomenaberrationen im fetalen Genom. Durch die Isolierung reiner und intakter fetaler Zellen aus mütterlichem Blut sowie durch die genetische Analyse der gesamten genomamplifizierten fetalen DNA kann dieses Problem gelöst werden.
Herausforderungen der Isolierung einzelner fetaler Zellen und ihre Lösung mit dem CellCelector™
Im mütterlichen Blut zirkulierende fetale Zellen sind extrem selten: es gibt nur 1 bis 2 fetale Zellen pro ml Blut. Daher ist die Gewinnung reiner fetaler Zellen aus dem mütterlichen Blut in ausreichender Anzahl für eine nachfolgende genetische Analyse technisch schwierig. Sie erfordert eine effiziente vorherige Anreicherung, den Nachweis mit geeigneten zelltypspezifischen Markern und eine extrem spezifische, präzise und schonende Einzelzellisolierung, die die Beschädigung und den Verlust seltener Zellen minimiert. Der Arbeitsablauf der fetalen Zellisolierung auf der Grundlage des ALS CellCelector™ kombiniert die Detektion seltener Zellen mit einer schonenden Gewinnung einzelner fetaler Einzelzellen aus angereicherten Blutproben und ist sowohl im Hinblick auf Geschwindigkeit als auch Präzision ausgesprochen attraktiv. (Abb. 2).
Abb. 2. Typischer Arbeitsablauf für die Isolierung und genetische Analyse einzelner fetaler Zellen aus mütterlichem Blut mithilfe des ALS CellCelector™ Einzelzellpicker. CFC: zirkulierende fetale Zellen; CMA: Chromosomale Microarrayanalyse; NGS: Next Generation Sequencing.
Abb. 3. Beispiel einer Galerie von fetalen Zellen, die mit dem ALS CellCelector™ nach dem in Abb.2 beschriebenen Arbeitsablauf detektiert wurden. Blau: DAPI; grün: Cocktail aus fetalzellspezifischen Antikörpern [Bilder mit freundlicher Genehmigung von Arcedi Biotech].
Abb. 4. Beispiele für Bilder vor und nach dem Picken, die automatisch vom CellCelector™ System gespeichert wurden. Einzelzell-Pickeffizienz: 100 % [Bilder mit freundlicher Genehmigung von Arcedi Biotech].
Einführung der zellbasierten (cb) NIPD in die Klinik
Die nachgewiesene Sensitivität und Genauigkeit der neuartigen cbNIPT-Methode, basierend auf der CellCelector™ Plattform, ermöglichte es unserem Kunden ARCEDI Biotech, den Test im Mai 2018 in der pränatalen Versorgung in der Zentralregion Dänemarks einzuführen. Diejenigen Frauen, die aufgrund eines kombinierten Ersttrimester-Screenings als "Hochrisiko" (>1:300) identifiziert wurden, haben nun die Möglichkeit, zwischen einem zellbasierten nicht-invasiven Test zusammen mit einem zellfreien NIPT oder einem konventionellen invasiven Test zu wählen. Die neue cbNIPT-Methode bietet null No-Calls, d.h. fetale Zellen werden in allen Fällen nachgewiesen und isoliert (Abb. 5). Im Durchschnitt werden 12,8 fetale Zellen pro Probe identifiziert. Die Abbildungen unten zeigen eine typische Galerie isolierter fetaler Zellen sowie Beispiele von Chromosomenaberrationen, die mit dieser Methode nachgewiesen wurden. Mit der derzeit entwickelten cbNIPT-Technik können Aneuploidie, Mikroduplikation, unausgewogene strukturelle Rearrangements und Mosaik-Fälle mit einer Kapazität zur Identifizierung subchromosomaler Aberrationen >10Mb erkannt werden (Abb.6). Das Endziel wäre es, den Screening-Test allen schwangeren Frauen anzubieten.
Abb. 5. Galerie von fetalen Zellen (Trophoblasten), angereichert und nachgewiesen aus mütterlichem Blut bei einem männlichen Fötus mit erhöhter Nackentransparenz (von Vestergaard et al.). Die Zellen wurden mit DAPI (blau) und einem Cocktail aus fetalen zellspezifischen Antikörpern (grün) angefärbt. Nach der Anreicherung wurde der CellCelector™ zur Detektion und Isolierung einzelner fetaler Zellen verwendet, gefolgt von einer WGA- und aCGH-Analyse. Das Ergebnis, das die Aneuploidie für Chromosom 21 bestätigt, ist in Abb.6 (Fall 1) dargestellt.
Abb. 6. Beispiel einer aCGH-Analyse an 5 zytogenetisch abnormen Fällen. 1: Trisomie 21; 2: Trisomie 13 (Mosaik); 3: Trisomie 2 (Mosaik); 4: partielle Trisomie 21 (12,4-Mb-Duplikation); 5: unbalancierte Translokation einschließlich 31-Mb-Deletion auf Chromosom 4p und 30-Mb-Duplikation auf Chromosom 8p (Abbildung von Vestergaard et al.). Alle mütterlichen Blutproben wurden für die cbNIPT vor dem invasiven Test entnommen und blind analysiert.
WEITERFÜHRENDE PUBLIKATIONEN
- Toft, C.L.F. et al. Cell-based non-invasive prenatal testing for monogenic disorders: confirmation of unaffected fetuses following preimplantation genetic testing. J Assist Reprod Genet 38, 1959–1970 (2021).
- Jeppesen L.D. et al. Cell-based non-invasive prenatal diagnosis in a pregnancy at risk of cystic fibrosis Prenat Diagn. 2021 Jan;41(2):234-240
- Hatt L. et al. Cell-based noninvasive prenatal testing (cbNIPT) detects pathogenic copy number variations Clin Case Rep. 2020
- Singh R. et. al. Laboratory challenges with cell-based NIPT. ISPD Global Updates, November 2018
- Vestergaard E.M. et al. - On the road to replacing invasive testing with cell‐based NIPT: Five clinical cases with aneuploidies, microduplication, unbalanced structural rearrangement, or mosaicism. Prenatal Diagnostics 37(11):1120-1124 (2017)
- Kølvraa, S. et al. Genome-wide copy number analysis on DNA from fetal cells isolated from the blood of pregnant women Prenatal Diagnostics 36: 1-8 (2016)
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