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Verlustfreie Prozessierung seltener Einzelzellen

Hier sind Ihre seltenen Zellen sicher: Trennen, färben und isolieren von Einzelzellen ohne Zellverlust

Mit den SIEVEWELL Chips ist jetzt eine neue Generation von Nanowell-Arrays verfügbar. Hierbei handelt es sich um einen Kammer-Objektträger, der am Boden der Flüssigkeitskammer eine zusätzliche Nanowell-Struktur aufweist. Am Boden eines jeden Nanowells befinden sich zudem zwei Mikroporen, die eine Verbindung zu einem kleinen Flüssigkeitsspalt unterhalb der Nanowells ermöglichen. Dadurch ist es möglich, Zellen innerhalb der Nanowells einzufangen und eine einseitig gerichtete Strömung von der Oberseite der Flüssigkeitskammer durch die Poren in den darunter liegenden Flüssigkeitsspalt zu erzeugen. Dank dieses Designs ist es nun möglich, nicht nur einzelne Zellen zu trennen und in den Nanowells einzufangen, sondern sie auch direkt in diesen Wells zu bearbeiten, z.B. zu waschen, zu färben oder Antikörpermarkierungen durchzuführen, ohne dabei Zellen zu verlieren. Diese völlig zellverlustfreie On-Chip Bearbeitung macht die Technologie von SIEVEWELL für seltene Einzelzellanwendungen, wie z.B. die Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen, fötalen Zellen etc. äusserst attraktiv.

Das Design der SIEVEWELL Chips in Kombination mit der CellCelector Technologie erlaubt eine vollständige Automatisierung der Identifikation einzelner Zellen sowie eine 100%ig reine Isolierung der gewünschten Zielzellen.

SIEVEWELL™: Technische Details

Design

  • Standard Objektträgerformat
  • Biokompatible Materialien frei von zytotoxischen Substanzen
  • Dünne Membran mit Nanowells
  • Ultra-Low-Attachment (ULA) Oberfläche um das Anhaften von Zellen an der Plattenoberfläche zu verhindern.
  • Größe der Nanowells: 20 µm Breite und 25 µm Tiefe. Perfekt geeignet für die effiziente Aufnahme einzelner Zellen.
  • 370.000 Nanowells pro Chip (17 x 17 mm)
  • Die hexagonale Struktur der Nanowells ist ideal für eine automatisierte Zelldetektion und Zellzählung.
  • Zwei Mikroporen mit 2 µm Durchmesser am Boden jedes einzelnen Nanowells erlauben den Flüssigkeitsdurchtritt und halten die Zellen zurück.
Struktur der SIEVEWELL™ Membran. Sicht von oben auf die Nanowells.
Struktur der SIEVEWELL™ Membran. Seitenansicht der Nanowells.
Hellfeldansicht der SIEVEWELL™ Membran. Die Poren am Boden der Membran sind gut sichtbar.

Optische Eigenschaften der SIEVEWELL™ Membran


  • Hohe Transparenz in der Hellfeldmikroskopie.
  • Sehr geringe Autofluoreszenz.

Aufgrund dieser Eigenschaften eignet sich die SIEVEWELL Technologie hervorragend für mikroskopische und optische Messungen und ermöglicht die Aufnahme hochwertiger mikroskopischer Bilddaten.

SIEVEWELL™: So funktioniert es

Auf dem Boden eines jeden einzelnen der 370.000 Nanowells eines SIEVEWELL Chips befinden sich zwei Mikroporen mit einem Durchmesser von je 2 µm. Sie verbinden das Flüssigkeitsvolumen ober- und unterhalb der Wells. Das Flüssigkeitsvolumen unter den Nanowells ist über einen Mikrospalt unterhalb der Chipmembran mit zwei seitlichen Anschlüssen verbunden.
Nach der Beladung des Chips mit der Zellsuspension kann durch Ansaugen der Flüssigkeit mit einer Standardpipette ein einseitig gerichteter Flüssigkeitsstrom von der inneren Flüssigkeitskammer zu den seitlichen Anschlüssen erzeugt und kontrolliert werden. Die Zellen folgen dem Flüssigkeitsstrom und werden in den Nanowells festgehalten. Indem die Zelle ein Nanowell besetzt, blockiert sie die Mikroporen dieses Wells und der Flüssigkeitsstrom durch dieses Nanowell wird reduziert. Weitere Zellen werden dadurch automatisch in andere, noch leere Nanowells umgelenkt, was letztendlich zu einem sich selbst sortierenden Nanowell-Array führt. Im Anschluss an die Zellbeladung kann die Zellfärbung direkt auf dem Chip auf die gleiche Weise ohne Zellverlust während Fixierung, Permeabilisierung, Blockierung, Inkubation und Waschen durchgeführt werden.

SIEVEWELL™ Ablauf der verlustfreien Einzelzellisolierung mit  Färbung direkt auf dem Chip

Schritt 1
Beladung mit Zellen

Schritt 2
Färben

Schritt 3
Detektion

Schritt 4
Rückgewinnung

Step 5
nachfolgende Analyse

1. Beladung mit Zellen

Laden der angereicherten oder bearbeiteten Einzelzell-Suspension auf den Chip. Die SIEVEWELL Technologie ist mit lebenden und fixierten Zellen kompatibel.
Schritt 1
Die Einzelzellsuspension wird in die Kammer des SIEVEWELL Chip pipettiert.


Schritt 2
Der Puffer wird über die seitlichen Anschlüsse des SIEVEWELL Chip abgesaugt.


Durch das Ansaugen mit der Pipette wird ein gerichteter Fluss von der inneren Kammer durch die beiden Mikroporen am Boden jedes einzelnen Nanowells zur Pipette an dem seitlichen Anschluss erzeugt.
Die Zellen bewegen sich mit dem Flüssigkeitsstrom nach unten und werden in den Nanowells festgehalten, da die Mikroporen klein genug sind, um den Durchtritt der Zellen zu verhindern.

Aufgrund der Größe der Nanowells kann nur eine Zelle pro Well eingefangen werden. Beim Eintritt in das Nanowell verstopft die Zelle die Poren und reduziert somit den Flüssigkeitsstrom durch dieses Well. Dadurch werden nachfolgende Zellen automatisch in die umgebenden, leeren Nanowells umgelenkt, was zu einer selbstsortierenden Einzelzellenerfassung mit sehr hoher Effizienz führt.
A549 Zellen geladen auf einen SIEVEWELL™ Chip

2. Färben und Waschen der Zellen

Zugabe der Reagenzien, inkubieren und waschen zum verlustfreien Anfärben der Zellen. Vor der Färbung ist auch eine Fixierung möglich.
Schritt 1
Reagenzien oder Waschlösung werden in die Kammer des SIEVEWELL Chip pipettiert.
Rechts: Fluoreszenzbild vor dem Waschen
Schritt 2
Überschüssige Reagenzien oder Waschpuffer werden über die seitlichen Anschlüsse des SIEVEWELL Chip abgesaugt. Da die Zellen in den Nanowells gefangen sind, können sie während dieser Prozedur nicht verloren gehen.
Rechts: Fluoreszenzbild nach dem Waschen

3. Detektion

Um die Zielzellen zu detektieren, wird der Chip mit dem CellCelectorgescannt. Die Zellen sind in den Nanowells immobilisiert und behalten ihre Originalposition während des Scanvorgangs bei. Aufgrund der hohen Planarität der SIEVEWELL Chips kann der gesamte Bereich des Chips gescannt werden, ohne die Fokuseinstellungen zu verändern.
Scan mit dem ALS CellCelector™
Blau: DAPI; Grün: A549 Zellen; Rot: Namalwa Zellen
Zirkulierende Tumorzelle gefangen im Nanowell

4. Rückgewinnung

Die Zielzellen werden in PCR Gefäße oder Zellkulturplatten überführt. Die SIEVEWELL Chips wurden speziell für die Verwendung auf dem automatisierten Einzelzell-Pickingsystem CellCelector der ALS GmbH optimiert.
Einzelzellrückgewinnung mit dem ALS CellCelector™
Isolierte A549 Zelle im Zielwell

5. Nachfolgende Analyse

Die SIEVEWELLTechnologie ist kompatibel mit einer Vielzahl molekular-biologischer Analysemethoden, u.a. Einzelzell DNA Next generation Sequenzierung, RNA Sequenzierung etc. Lebende Zellen können auch kloniert werden.
Einzelzell RT-PCR wurde durchgeführt unter Verwendung genspezifischer Primer für GAPDH.
PC: positive Kontrolle, c-DNA von gepoolten A549 Zellen
NC: negative Kontrolle, Lysepuffer
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ZUGEHÖRIGE PRODUKTE
CellCelector for single cell isolation
CellCelector
Sievewell nanowell arrays
  SIEVEWELL™ Nanowell Arrays  
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