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Splitting von HSC Tochterzellen

Isolierung von HSC Tochterzellen oder “Dublettenspaltung”

Hämatopoetische Stammzellen (HSC) stehen an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie und sind für den Aufbau und die Aufrechterhaltung eines funktionierenden Blutsystems verantwortlich. HSC erreichen dies, indem sie in der Lage sind, sich selbst zu erneuern und die vielfältigen Linien des hämatopoetischen Blutsystems hervorzubringen. Dabei ist das Gleichgewicht von Selbsterneuerung und Differenzierung für die gesunde Funktion unseres Blutsystems von großer Bedeutung.

Die Dynamik, die zu dem einen oder anderen Stammzellverhalten führt, ist jedoch nicht vollständig verstanden. Eine Möglichkeit, die Entscheidung über das weitere Verhalten zu untersuchen, ist der CFC-Assay (siehe Hämatopoetische Stammzellkolonien). Der CFC-Assay untersucht zwar die Koloniebildung aus einzelnen Stammzellen oder Vorläuferzellen, unterscheidet aber nicht zwischen einzelnen Zellen innerhalb dieser Kolonien. Daher besteht eine weitere Möglichkeit zur Untersuchung von Entscheidungen über das Zellverhalten darin, die "Tochter"-Zellen, die von einer "Mutter"-HSC stammen, auf Einzelzellebene in molekularen und funktionellen Assays wie Einzelzell-Sequenzierungs- oder Transplantationstests zu untersuchen.

Unabhängig von der anzuwendenden Methode müssen jedoch zunächst einzelne "Tochter"-Zellen isoliert werden (hier auch "Dublettenspaltung" genannt). Insbesondere für funktionelle Assays, aber auch für Expressionsstudien ist es wichtig, dass die Isolierung unter Bedingungen durchgeführt wird, die die molekularen Programme der Zellen minimal beeinflussen. Die Isolierung von HSC aus Knochenmark- oder Blutproben wird in der Regel mittels FACS durchgeführt. Aufgrund der geringen Gesamtzellzahl (bis hinunter zu 2 Tochterzellen) ist dies jedoch keine Option für die Dublettenaufspaltung. In der Vergangenheit wurde das Dublettensplitting durch serielle Verdünnung realisiert, d.h. durch Pipettieren der Zellen von einem Well in ein anderes, bis die Zellen singularisiert sind. Diese Methode ist jedoch nicht sehr schonend und birgt ein hohes Risiko, die Zellen zu beschädigen oder sogar zu verlieren. Außerdem neigen Dubletten dazu, aneinander zu sitzen, was den Erfolg der seriellen Verdünnung verringert.

Hier stellen wir eine bessere Option für die sanfte Isolierung von Tochterzellen vor, die die Rückverfolgbarkeit jeder einzelnen Zelle ermöglicht: Mit dem interaktiven Pickmodus des CellCelectors™ können Dubletten geteilt werden, während man anhand eines Live-Bildes den vollen Überblick über das, was mit den Zellen geschieht, behält, ohne dass das Risiko eines Zellverlustes besteht. Darüber hinaus ist das Picken durch den CellCelector sehr sanft zu den Zellen und minimiert den Einfluss auf die molekularen Programme der Zellen. Außerdem wird der Pick-Prozess genau dokumentiert, was eine vollständige Rückverfolgbarkeit ermöglicht.
Tochterzellen, die von einer HSC abstammen
Beginn der Dublettenspaltung
Zielzelle bewegt sich zur Kapillare
Zielzelle bewegt sich zur Kapillare
Sanftes Aufsaugen der Zielzelle
A: Tochterzellen, die von einer HSC stammen, der rote Pfeil markiert die zu isolierende Zelle.
B: Um Dubletten zu spalten, wird die Kapillare an einer Stelle neben der Zelle, die gepickt werden soll (roter Pfeil), und am weitesten von den anderen Zellen entfernt platziert.
C:  Durch Kapillarkräfte angezogen, beginnen sich die Zellen nun in Richtung der Kapillare zu bewegen, wobei sich die Zelle, die am nächsten an der Kapillare sitzt, am schnellsten bewegt (roter Pfeil).
D: Sobald die Zelle nicht mehr entkommen kann, wird die Kapillare von den anderen Zellen wegbewegt, bis der Abstand zwischen der angezogenen Zelle und den anderen Tochterzellen groß genug ist, um ein sicheres Einzelzellpicken zu ermöglichen (E).
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