幹細胞コロニーのクローンピッキング
生物医学および製薬研究のためのコロニー分画および幹細胞コロニーの正確な分離
幹細胞は、自己複製と分化の可能性が高く、生物医学、製薬研究および再生医療の分野におけるアプリケーションで幅広く卓越した役割を果たしています。
分化した細胞を多能性幹細胞（いわゆる人工多能性幹細胞またはiPS細胞）に再プログラミングすることが可能であるという発見は、幹細胞研究に大きな刺激を与えました。応用分野や研究分野の幅は非常に広く、絶大な期待が持たれています。
研究では、iPS細胞は細胞性疾患モデルの開発や新薬開発のテストシステムとして使用されています。さらに、iPS細胞は、細胞および組織の変性疾患の新しい治療法を開発するための再生医療において、治療に関連する可能性があると考えられています。iPSを使用することで、さまざまな種類の組織を培養できるようになり、代替組織として、または研究目的で使用できるようになりました。
人工多能性幹細胞を生成するために、細胞は遺伝子編集の対象となります。しかし、遺伝子編集は均一な細胞集団をもたらすのではなく、遺伝子統合が逸脱しているために表現型が異なるシングル細胞をもたらします。
したがって、シングル細胞プールのクローン増殖を観察することが重要です。クローン細胞集団を取得するために、シングル細胞をクローンに成長させてから、個々のクローンを単離します。
iPS細胞のクローンプールを生成するプロセス全体は非常に時間がかかります。確立された方法を使用すると、100個の組織細胞のうち1個以下のみがiPS細胞に変換されます。
したがって、目的の幹細胞コロニーまたはクローンの同定と標的分離の両方のための自動化されたソリューションに対する高い需要があります。自動化の要件は非常に高いです。ターゲットオブジェクトは、隣接するクローンからのクロスコンタミネーションなしに、明確な「細胞の識別」+「細胞の分離」を行う必要があります。さらに、細胞の望ましくない変化や分化を避けるために「細胞分離」+「細胞移動」は可能な限り穏やかでなければなりません。
ALS CellCelector™ 付着細胞と細胞コロニーを選択するために特別に設計されたスクレーププロセスは非常に穏やかで、非常に特異的であるため、幹細胞、幹細胞コロニーのクローン継代、および幹細胞コロニーの特定の部分の分離に最適です。
シングル幹細胞、幹細胞コロニーまたは部分コロニーを選択するためのモジュール
特定のコロニー部分、例えば幹細胞コロニー内の未分化領域の正確な分離、およびシングル幹細胞の分離には、シングル細胞モジュールを使用できます。このモジュールは、20 µmから最大220 µmまでのさまざまな直径で利用可能なガラスキャピラリーを利用しています。
胚様体、スフェロイド、オルガノイド、造血幹細胞コロニーなどの3Dコロニーを分離するには、セミソリッドメディアモジュールが最適なツールです。コロニーのサイズに応じて、2つの異なる直径が利用可能です。
アプリケーション
- 新たに派生したiPSコロニーのクローンピッキング
- ゲノム編集後のコロニーピッキング（CRISPR）
- 2つまたは3つの分配プレートへの転送を伴うコロニー分割（レプリカプレートの作成）
- 分化した幹細胞コロニーの分離
- メチルセルロースからの造血幹細胞コロニーのスキャンと分離
- シングル幹細胞の分離（シングル細胞クローニングまたは不均一性研究）
- 分化した領域の除去による幹細胞培養のクリーンアップ
ALS CellCelector™ による人工多能性幹細胞（iPS）および胚性幹細胞コロニーの自動分離
幹細胞コロニーの移入はしばしばストレスの多い手順であり、その結果、多数の死んだ細胞が生きている隣人に影響を及ぼします。トリプシンまたは同様の酵素消化法を使用してコロニーの移動を促進すると、特に新しく再プログラムされた幹細胞の表現型に明確な影響を及ぼし、意図しない分化を引き起こす可能性があります。さらに、クローン性が失われたさまざまなコロニーの相互汚染につながる可能性があります。ピペットチップまたはセルスクレーパーを使用した手動スクレイピングを使用した機械的トランスファーの組み込みは面倒ですが、クローンコロニートランスファーの要件をほとんど満たしていません。
iPSコロニーの自動分離：概要画像は、対応するウェルのスキャン全体を示し（左側の画像）、画像を選択する前後に、選択プロセスのドキュメントを提供します（中央と右側の画像）。
多能性を維持しながら、高い生存率のための付着細胞の穏やかな剥離
付着コロニーのピッキングはALSCellCelector™ 非常に穏やかな前後左右方向のスクレイプの動きと、コロニーの同時吸引を組み合わせています。これにより、培養プレートまたはフィーダー細胞層のベースからコロニーが穏やかに緩みます。
ヨウ化プロピジウム（PI）染色を使用して、新しいプレートに移した後、手動および自動で選択したhESCコロニーの細胞生存率を評価しました。
画像は、手動ピッキングと比較して、自動的に分離された場合の死細胞の数が少ないことを示しています。
hESCの位相差画像は、PI染色の対応する蛍光画像とマージされました。（スケール50 µm）
左：手動で分離されたコロニー、右：転送後に自動的に分離されたコロニー。
コロニーの形態はまた、その現在の状態に関する重要な情報を提供することができます。代表的なコロニーの位相差画像は、新しい培養ディッシュへの自動継代の3日後（左）と5日後（右）に撮影されました。コロニーは正常な成長を示しました。これは、CellCelector™で自動的に選択された幹細胞コロニーが、同じ継代の手動で選択されたコロニーと有意差を示さないことを示しています。成長行動も同等です。
新しい培養ディッシュへの自動継代後の代表的なコロニーの位相差画像
左：継代後3日。右：継代後5日
幹細胞がCellCelector™ピッキングプロセスにどのように反応するかをテストするには、多能性の状態に関するhESCコロニーは、多能性関連マーカーOct4、SSEA-1、Tra-1-60、およびNanogについて染色されました。
典型的なマーカーの免疫細胞化学的発現分析は、細胞移植の影響を解明するための信頼できる方法です。多能性の維持または細胞運命の決定において極めて重要な役割を果たす特定のタンパク質は、蛍光標識抗体によって視覚化でき、CellCelector™ イメージングソフトウェアによって簡単に検出できます。
hESCコロニーの多能性を確認することができ、発現レベルは従来の増殖hESCの発現レベルに匹敵します。
多能性関連表面マーカーTra-1-60（B）、多能性因子Oct4（C）およびNanog（D）、および分化したヒト細胞の表面マーカーであるSSEA-1（E）の免疫細胞化学的染色。一次抗体は、Alexa-555結合二次抗体で視覚化されました。細胞核はヘキストまたはDAPIで対比染色されました。
（F）多能性関連マーカーTra-1-60および分化マーカーSSEA-1を発現する細胞の定量化は、FACS分析によって行われました。
フィーダー細胞層からの未分化幹細胞コロニーの分離
これは、幹細胞の安定性と生存能力を維持する環境を提供するために、未分化幹細胞をフィーダー細胞（主に線維芽細胞）と共培養するために一般的に使用される方法です。
ただし、フィーダー細胞を移さずに幹細胞を分離するには、洗練されたスキルが必要です。ALS CellCelector™ はフィーダー細胞から幹細胞コロニーの自動転送を可能にします。
フィーダー細胞上のヒト胚性幹細胞（hESC）
遺伝子編集後のクローンピッキング
遺伝子組み換えモデル生物は、生理学的環境における遺伝子の機能と調節を調べるために使用できるため、生物学的関係の研究や病気の調査にとって非常に重要です。彼らの助けを借りて、基礎研究で新しい洞察を得ることができ、それは新しい形の治療法に反映することができます。
トランスジェニック生物を生成するための古典的な方法の最初のステップは、胚性幹細胞のトランスフェクションとそれに続く陽性クローンの選択からなります。ALS CellCelector™ はシングル細胞からクローンへの洗練された画像ドキュメンテーションと、成長したクローンの正確で穏やかな分離+転送を組み合わせることにより、個々の細胞コロニーのクローンピッキングに最適です。
レプリカプレートの生成
コロニーのサイズが十分に大きい場合、1つのコロニーを2つ以上のレプリカプレートに自動的に選択できます。一方のデスティネーションプレートは培養に使用でき、もう一方は品質管理PCR分析に使用できます。
幹細胞コロニーからの特定の部分の分離
その強力な光学およびイメージングソフトウェア、ならびにその高精度により、ALS CellCelector™ は幹細胞コロニーから特定の領域を分離することもできます。幹細胞コロニーの形態学的特性と違いに基づいてCellCelector™ はたとえば、コロニーの分化した部分と未分化の部分を区別し、それらを選択的に選択することができます。
ALS CellCelector™ を使用したhESCコロニーからのすでに分化した部分の分離。
ALS CellCelector™ のシングルセルモジュールを使用した、ヒト胚性幹細胞（hESC）コロニーの特定の未分化部分の分離。
半固形培地からの胚様体（EB）の分離
幹細胞コロニーは、メチルセルロースやマトリゲルなどの高粘度培地を使用して3Dで培養し、製薬研究や臓器形成研究で興味深いオルガノイドまたは胚様体を形成することができます。CellCelector™ 半固体メディア専用のピッキングモジュールを備えているため、これらの構造の分離に最適です。
関連する出版物
- Cohen, I.S. et al. DNA lesion identity drives choice of damage tolerance pathway in murine cell chromosomes Nucl. Acids Res. 43(3): 1637-45 (2015)
- Shipony, Z. et al. Dynamic and static maintenance of epigenetic memory in pluripotent and somatic cells Nature 513(7516): 115-9 (2014)
- Marx, U. et al. Automatic Production of Induced Pluripotent Stem Cells Procedia CIRP 5: 2-6 (2013)
- Haupt, S. et al. Automated selection and harvesting of pluripotent stem cell colonies Biotechnol. Appl. Biochem. 59(2): 77-87 (2012)
- Zoldan, K. et al. Automated harvest of induced pluripotent stem cell colonies and colony fractions using the cell separation robot CellCelectorTM nature methods application notes (2010)
- Zoldan, K. et al. Automated isolation of semi-adherent macrophage-like cells from a fibroblast-contaminated culture using the cell separation robot CellcelectorTM nature methods application notes (2010)
- Haupt, S. et al. Automated selection and harvesting of pluripotent stem cell colonies using the CellCelector Nature Methods (2009)
- Schneider, A. et al. "The good into the pot, the bad into the crop!" - a new technology to free stem cells from feeder cells PLoS One 3(11): e3788 (2008)
- Peterbauer, T. et al. Simple and versatile methods for fabrication of arrays of live mammalian cells Lab on a Chip 6(7): 857-63 (2006)
- Planes, E. et al. Life Cell Imaging for Quality Control of Pluripotent Stem Cell Culture Poster ISSCR 2013 Boston
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